Expressió de proteïnes
Blocs de contingut
Cell Disruptor – Constant Cell Disruption Systems
NGC FPLC instrument – Biorad
Centrifuge – Beckman Coulter
Dades provisionals
Centres CERCA
Barcelona, Spain
2005
Institut de Recerca Biomèdica (IRB Barcelona)
Propietaris
Equipament i Serveis
Clonació HTP personalitzada per generar vectors d'expressió La tècnica de clonació independent d'enzims de restricció i unió In-Fusion™ permet la producció precisa de construccions definides per l'usuari, inclosa la producció de construccions mutants, quimèriques i bicistròniques (només E. coli). Hi ha molts vectors preparats pOPIN1 o pPEU In-Fusion™ disponibles; feu clic aquí per descarregar la llista més recent o poseu-vos en contacte amb nosaltres. La majoria d'aquests vectors permeten l'expressió en E. coli (promotors basats en T7), cèl·lules de mamífers (potenciador CMV immediat i primerenc fusionat amb el promotor de ß-actina de pollastre) o cèl·lules d'insectes (promotor p10 i recombinació intracel·lular d'ORF 603 i 1629 amb genoma baculoviral). Generalment s'espera que l'investigador proporcioni la "plantilla" per a les operacions de clonació, però la instal·lació també pot obtenir plasmidis o cDNA. Cribratge d'expressió en E. coli Es pot examinar una placa de microtitració de 96 clons d'expressió (instal·lacions d'usuari o derivats) en E. coli en aproximadament una setmana. Actualment, el cribratge consisteix en l'ús de dues soques d'expressió, i l'expressió de cada soca es prova mitjançant IPTG i mètodes d'autoinducció. Es poden incorporar soques d'E. coli addicionals (DE3) al procés de cribratge si cal. Minipreparació del plasmidi HTP: 96 minipreparacions de pellets d'E. coli en format MTP en menys de dues hores Expressió de proteïnes personalitzades i purificació de proteïnes intracel·lulars o secretades a escala de mil·ligrams Un mínim de dos passos de purificació generalment ens proporcionen pureses de proteïnes superiors al 95% per a la majoria de proteïnes. Actualment, els hostes disponibles per a cultius d'expressió a gran escala són les cèl·lules d'E. coli i HEK293T, i actualment estem introduint cultius de cèl·lules d'insectes a gran escala a la nostra llista de serveis. El sistema de cèl·lules HEK293T s'ha utilitzat per produir amb èxit quantitats de mil·ligrams de proteïnes glicosilades secretades. Producció de proteïnes marcades amb seleni-metionina en soques d'E. coli auxotròfiques o prototròfiques per a la determinació de l'estructura cristal·logràfica La nostra compra a l'engròs de seleni-metionina produeix preus molt competitius per a les nostres proteïnes marcades amb E. coli. Producció de proteïnes marcades amb 15N, 13C o deuteri en soques d'E. coli auxotròfiques o prototròfiques per al cribratge d'expressió per RMN en cèl·lules de mamífers (per exemple, HEK293T). Es pot examinar una placa de microtitració de 96 clons d'expressió (derivats de la instal·lació o de l'usuari) a les cèl·lules en 1-2 setmanes. Producció de baculovirus recombinants utilitzant conjunts de vectors pOPIN o pPEU o a partir de construccions existents (per exemple, pFastBac). La recombinació a la cèl·lula (Sf9) dels vectors pOPIN i pPEU amb el genoma baculoviral és ràpida i sense fons. Les proteases recombinants 3C (PreScission), TEV i SUMO marcades amb His estan disponibles per a l'eliminació dels "socis" de fusió de les proteïnes expressades. També esperem que les glicosidases recombinants PNGase i EndoF1 estiguin disponibles per a l'eliminació de fragments de sucre de proteïnes recombinants glicosilades abans de la cristal·lització. La instal·lació també obté molts reactius d'alta qualitat, que van des de soques cel·lulars competents en E. coli especialitzades i reactius per a l'expressió de proteïnes fins a reactius d'etiquetatge i clonació per a ús d'investigadors individuals. La compra de reactius a través de les instal·lacions generalment és molt rendible.
Categorització
Dominis RIS3CAT
GINYS-IRB-003
Procediment d'accés i tarifes
Qualitat institucional
