Desenvolupament d'un sistema de cultiu 3D avançat per a l'enginyeria de teixits cardíacs humans

Maria Valls Margarit

Dra. Elena Martínez Fraiz Dr. Ángel Raya Chamorro

Dra. Elena Martínez Fraiz (IBEC) i Dr. Ángel Raya Chamorro (CMRB)

La cardiopatia isquèmica és una de les principals causes de mort humana a tot el món a causa de la mínima capacitat de reparació del cor després d'una lesió. A part del trasplantament de cor, actualment no hi ha teràpies efectives o duradores per a la insuficiència cardíaca en fase terminal. Per tant, és crucial desenvolupar no només teràpies alternatives que potenciïn la regeneració o reparació del cor, sinó també noves eines per estudiar la fisiologia i la fisiopatologia cardíaques humanes in vitro. En aquest context, l'enginyeria de teixits cardíacs sorgeix com una estratègia prometedora, ja que té com a objectiu generar anàlegs de teixit cardíac que actuïn com a models in vitro de teixit cardíac humà o com a substituts per a la reparació del cor. Així, tenir construccions de teixit cardíac humà en 3D que s'assemblin al miocardi humà podria revolucionar el descobriment de fàrmacs i les proves de toxicitat, el modelatge de malalties cardíaques i la medicina regenerativa. Una estratègia per obtenir construccions de teixit cardíac fiables és imitar l'entorn cardíac natiu. L'enfocament clàssic es basa en la sembra de cardiomiòcits en bastides 3D biocompatibles i després el cultiu de la construcció en un sistema de senyalització biomimètica, generalment un bioreactor. Tot i que s'han fet avenços importants, la generació de construccions de teixit gruixut i madur a partir de cardiomiòcits derivats de cèl·lules mare pluripotents induïdes humanes (hiPSC-CM) continua sent un repte. Per tant, la hipòtesi del nostre estudi és que la combinació de hiPSC-CM amb bastides 3D i senyals reguladors adequats pot conduir a la generació de construccions de teixit cardíac humà madur que s'assemblin al miocardi humà, tant funcionalment com estructuralment. Per abordar-ho, hem caracteritzat una bastida 3D basada en col·lagen i hem establert un mètode eficient per a la sembra de cèl·lules a la bastida. També hem desenvolupat un sistema de bioreactor de perfusió paral·lelitzada, que garanteix un transport de massa eficaç entre les cèl·lules i el medi de cultiu i permet cultivar múltiples rèpliques de construccions de teixit. A més, hem dissenyat i fabricat una cambra de perfusió que inclou elèctrodes per estimular elèctricament les cèl·lules durant el cultiu, així com per controlar la funció dels teixits. Amb aquest sistema de cultiu 3D avançat, hem pogut generar construccions cardíaques humanes 3D gruixudes amb funcionalitat similar a la dels teixits. Els nostres resultats indiquen que la perfusió del medi de cultiu combinada amb l'estimulació elèctrica i una estructura basada en col·lagen millora la maduració estructural i funcional de les hiPSC-CM. En termes generals, l'estimulació elèctrica ha millorat l'organització estructural, l'alineació i l'acoblament dels cardiomiòcits en les nostres construccions de teixit cardíac. A més, l'estimulació elèctrica ha promogut la formació de construccions contràctils síncrones a macroescala amb funcions electrofisiològiques millorades. Mitjançant el desenvolupament d'un nou sistema de registre electrofisiològic, informem per primera vegada que coneixem d'una tècnica que proporciona informació sobre l'activitat elèctrica de construccions de teixit cardíac intactes en temps real. Concretament, la combinació de potencials d'acció generats per les hiPSC-CM que componen construccions cardíaques produeix senyals similars a l'ECG, que es podrien monitoritzar en línia. Finalment, hem demostrat la capacitat de les construccions de teixit cardíac humà estimulades per detectar cardiotoxicitat induïda per fàrmacs, ja que es podien observar característiques típiques de les arrítmies (per exemple, prolongació dels intervals RR i bloquejos regulars) després del tractament amb sotalol. En conjunt, els resultats indiquen que es poden obtenir construccions macroscòpiques de teixit cardíac humà amb funcionalitat similar a la del teixit mitjançant l'ús del nostre sistema de cultiu 3D avançat. Hem estudiat els efectes de l'estimulació elèctrica sobre els cardiomiòcits a múltiples nivells: molecular (presència, distribució i expressió de proteïnes cardíaques), ultraestructural (amplada del sarcòmer i presència d'unions cel·lulars especialitzades), cel·lular (morfologia i alineació) i funcional (amplitud, direccionalitat i tensió de les contraccions, i registres electrofisiològics). Els resultats validen el nostre enfocament in vitro com un sistema valuós per obtenir pegats cardíacs en 3D amb una maduresa i funcionalitat millorades. És important destacar que el sistema de monitorització en línia desenvolupat en aquest estudi pot proporcionar informació electrofisiològica essencial de construccions de teixit cardíac intactes, cosa que obre innombrables possibilitats en el camp de la investigació cardiovascular.

Actualment, l'avaluació de la toxicitat dels nous fàrmacs es duu a terme durant la fase preclínica de desenvolupament, utilitzant models animals i línies cel·lulars cultivades in vitro com a mètodes estàndard. Tanmateix, cap dels dos mètodes és capaç de recapitular la complexitat de la fisiologia del cor humà i, per tant, de predir de manera fiable la resposta del teixit cardíac humà als fàrmacs. De fet, aquesta és la causa principal del gran percentatge de fàrmacs retirats del mercat després de ser aprovats per la Food and Drug Administration (FDA), ja que molts d'ells causen arrítmies cardíaques quan arriben a la fase clínica. En aquest context, el model in vitro de teixit cardíac humà desenvolupat en aquesta tesi doctoral és un mètode molt prometedor per estudiar la cardiotoxicitat dels fàrmacs, superant així les limitacions dels mètodes estàndard actuals. Mitjançant l'ús de cèl·lules cardíaques derivades de cèl·lules pluripotents induïdes humanes (hiPSCs) i proporcionant-los un entorn favorable per a la seva maduració, organització i funcionalitat, hem pogut recapitular part de la complexitat del teixit cardíac humà. Una de les característiques més rellevants d'aquest model és la seva capacitat per predir els efectes cardiotòxics dels fàrmacs que van ser aprovats i comercialitzats i que posteriorment es va demostrar que eren aritmogènics. Per tant, el model de teixit cardíac humà que s'ha desenvolupat podria convertir-se en una nova generació de models in vitro per estudiar la cardiotoxicitat de nous fàrmacs. Atès que la toxicitat cardíaca és la principal causa de retirada de fàrmacs del mercat, fins i tot de fàrmacs no dissenyats per al tractament de malalties cardiovasculars (per exemple, agents quimioterapèutics), el model que proposem pot ser de gran interès per a la indústria farmacèutica. Aquest nou model 3D de teixit cardíac permetria una selecció més eficient del fàrmac candidat, amb la consegüent reducció de temps i costos associats al desenvolupament de nous fàrmacs. A més, també permetria una reducció del risc dels individus que participen en assajos clínics, cosa essencial per a qualsevol indústria farmacèutica. El fet que aquest nou model per avaluar la cardiotoxicitat dels fàrmacs es basi en l'ús de cèl·lules iPS humanes permetria el desenvolupament de diferents models de malaltia i pacients específics, avançant així en el camp de la medicina personalitzada. Per tant, l'interès principal de la indústria farmacèutica en tots aquests aspectes garantiria una implementació ràpida de la tecnologia. A més, s'espera una entrada curta al mercat a causa de la manca d'un marc regulador específic i complex i també al grau de maduresa de la tecnologia (prototip ja provat a nivell de laboratori). Per tal de transferir la tecnologia, es consideren tres sectors d'interès: (I) empreses que ofereixen serveis de proves de cardiotoxicitat, (II) empreses que proporcionen productes per a proves de cardiotoxicitat i (III) indústries farmacèutiques que volen introduir la tecnologia en el seu procés de descobriment de fàrmacs. El client més obvi per transferir la tecnologia ràpidament seria una empresa líder mundial que ofereixi productes o serveis relacionats amb l'avaluació de la cardiotoxicitat de fàrmacs, amb experiència i capacitat per comercialitzar cèl·lules hiPS, accés a professionals del sector, xarxa de vendes pròpia i una sòlida experiència en el camp.

Ischemic Heart Disease; Heart Failure; Heart Regeneration; Heart Repair; Human Cardiac Physiology; Human Cardiac Pathophysiology; In Vitro Models; Cardiac Tissue Engineering; Cardiac Tissue Analogues; 3D Human Cardiac Tissue Constructs; Human Myocardium; Drug Discovery; Toxicity Testing; Cardiac Disease Modelling; Regenerative Medicine; Native Cardiac Environment Mimicry; Cardiomyocytes; Biocompatible 3D Scaffolds; Biomimetic Signaling System; Bioreactor; Thick Tissue Constructs; Mature Tissue Constructs; Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CM); Collagen-Based 3D Scaffold; Cell Seeding; Parallelized Perfusion Bioreactor System; Effective Mass Transport; Multiple Replicas; Perfusion Chamber; Electrodes; Electrical Stimulation; Tissue Function Monitoring; Tissue-Like Functionality; Structural Maturation; Functional Maturation; Structural Organization; Alignment; Cardiomyocyte Coupling; Synchronous Contractile Constructs; Macroscopic Scale; Electrophysiological Functions; Electrophysiological Recording System; Electrical Activity; Intact Cardiac Tissue Constructs; Real Time Monitoring; Action Potentials; ECG-like Signals; Online Monitoring; Drug-Induced Cardiotoxicity; Arrhythmias; RR Intervals Prolongation; Regular Blockades; Sotalol Treatment; Advanced 3D Culture System; Molecular Level; Cardiac Proteins; Ultrastructural Level; Sarcomere Width; Specialized Cellular Junctions; Cellular Level; Morphology; Contraction Amplitude; Contraction Directionality; Contraction Strain; Electrophysiological Recordings; In Vitro Approach; 3D Cardiac Patches; Improved Maturity; Improved Functionality; Cardiovascular Research.