Diagnòstic clínic i detecció de patògens amb un nou biosensor nanofotònic multiplexat per al punt de cura

Núria Fabri Faja

Alonso Chamarro, Julian Estevez Alberola, Mari Carmen Prof. Laura M. Lechuga

Sepsis is a clinical condition in which the immune system reacts aberrantly when a systemic infection occurs. Every year, 31 million cases of sepsis occur worldwide with an estimated mortality of 35%. The diagnosis of sepsis is criticized because every hour of delay in starting treatment leads to a significant reduction in the survival rate. In addition, the techniques used today (cell culture) for diagnosis usually take between 24 and 72 h and require specialized laboratories and trained personnel. That is why the main objective of this thesis is the development and application of a portable biosensor device for the diagnosis in less than one hour of sepsis through the direct and simultaneous detection of several inflammatory biomarkers and bacteria (and other microorganisms) in human fluids. This thesis is based on a European project called RAIS (HORIZON2020) and arises mainly motivated by the lack of analytical techniques and platforms for clinical diagnosis that are fast, efficient and reliable. The results obtained in this thesis have demonstrated the potential application of a new portable and integrated biosensor for the detection of two bacteria (Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa) in just 10 microliters (µL) of blood plasma. This detection has been done directly and without any type of labeling or amplification, which greatly simplifies the measurement process. In addition, thanks to the participation of a renowned public hospital, the Vall D'Hebron hospital, it has been possible to validate the biosensor with real patient samples. Specifically, it has been possible to discriminate between samples from healthy patients and samples from patients with bacterial infection (with sepsis) in less than an hour (30 minutes of incubation and 1 minute of measurement with the biosensor). These samples were analyzed with classic analysis techniques and a good correlation was obtained, which demonstrates that the technology is reliable and competitive. By applying this technology, the presence of infection in the blood can be detected quickly and easily in less than an hour, which will allow treatment with antibiotics to be started almost immediately. This will increase patient survival, shorten hospitalization times and, ultimately, represent significant savings for the healthcare system. It should be noted that the design of the biosensor will allow in the future to expand simultaneous detection to many more biomarkers such as other microorganisms or biomolecules.

L'objectiu del projecte era la cerca de la detecció múltiple i simultània de diversos biomarcadors relacionats amb la sèpsia. Concretament, la tesi ha estudiat la detecció i quantificació de tres proteïnes de diferents mides juntament amb dos bacteris que es troben habitualment en casos de sèpsia. A més, aquesta detecció s'havia de dur a terme directament, és a dir, sense l'ús de marcadors fluorescents o cromofòrics. Per a això, es va decidir utilitzar el format microarray, que consisteix en la distribució ordenada i controlada de diversos bioreceptors a la superfície sensora. Per a la disposició d'aquests bioreceptors a les superfícies del sensor, va ser necessari utilitzar i manejar tecnologies de dispensació de volum que siguin capaces de distribuir quantitats minúscules (nL) de solucions de manera controlada. Gràcies a això, tot i que en aquesta tesi hem treballat amb tres bioreceptors de proteïnes i dos de bacteris, en el futur, amb l'ús d'aquestes tecnologies, serà possible col·locar fins a 1.600 bioreceptors diferents distribuïts al llarg de la superfície del sensor, cosa que ens permetrà assolir un dels multiplexos sense marcadors més alts. Dels dos tipus de biomarcadors analitzats, la detecció directa de bacteris ha estat l'estratègia més reeixida, ja que ha ofert millors resultats i sens dubte té un gran potencial per ser aplicada directament en l'àmbit clínic. Els dos bacteris amb què s'ha treballat han estat Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa i, la seva detecció individualitzada, ha demostrat que es poden assolir límits de detecció de 100 i 146 bacteris/mL, cosa que extrapolada al volum de mesura (que són 10 microlitres de plasma sanguini) dóna la possibilitat de detectar 1 i 2 cèl·lules bacterianes directament. A més, gràcies a la col·laboració de l'hospital públic Vall D'Hebron, s'han analitzat diferents mostres reals de pacients. Concretament, el biosensor POC ha pogut discriminar mostres de pacients amb sèpsia de les de pacients sans. Tot això utilitzant només els esmentats 10 uL de plasma dels pacients i en menys d'una hora (30 minuts d'incubació més 1 minut de lectura del biosensor). Així mateix, aquestes mostres també es van analitzar amb tècniques diagnòstiques clàssiques i es va aconseguir una bona correlació. En resum, tot això ha demostrat que la combinació del biosensor POC juntament amb les metodologies d'anàlisi bioquímica desenvolupades a la tesi proporcionen una prova ràpida, eficaç i fiable que es pot utilitzar com a eina de diagnòstic. A més, donat el grau d'integració i portabilitat que té el biosensor POC, aquesta prova es pot realitzar sense necessitat de grans infraestructures com ara laboratoris microbiològics especialitzats o de personal altament qualificat. Mitjançant l'aplicació d'aquesta tecnologia, es pot detectar la presència d'infecció de manera ràpida, fàcil i en menys d'una hora, cosa que permetrà iniciar tractaments antibiòtics gairebé immediatament. Això augmentarà la taxa de supervivència, escurçarà l'estada hospitalària i, finalment, comportarà un estalvi significatiu per als sistemes de salut pública. Així mateix, és rellevant afegir que, com s'ha esmentat anteriorment, els bioreceptors es dispensen i es troben de manera controlada sobre la superfície nanosensora, de manera que, tot i que en aquesta tesi s'ha aplicat el dispositiu biosensor POC per a la detecció de bacteris causants de sèpsia, en el futur serà possible immobilitzar bioreceptors relacionats amb altres agents infecciosos o altres biomarcadors rellevants per a altres malalties. També destaquem que en la fase de disseny del biosensor duta a terme per al projecte europeu, des del principi es va considerar l'aplicació del biosensor POC perquè fos compatible amb cartutxos d'un sol ús que continguessin la superfície del sensor amb els bioreceptors específics per a cada malaltia o condició clínica. Això significaria que els hospitals podrien disposar de la plataforma de diagnòstic portàtil (el biosensor POC) i comprar diferents cartutxos dirigits a diferents malalties. Finalment, voldria afegir que, a partir dels resultats obtinguts, el grup de recerca on es va dur a terme la tesi ha començat a negociar possibles acords comercials amb empreses interessades a tenir sistemes tipus POC per a l'anàlisi ràpida d'infeccions i la possibilitat d'estendre-ho a l'estudi de la resistència als antibiòtics del microorganisme detectat, per tal de proporcionar de manera més eficaç la teràpia més adequada per a cada pacient.

Sepsis; Clinical Condition; Immune System; Systemic Infection; Mortality; Diagnosis Delay; Survival Rate; Cell Culture; Specialized Laboratories; Trained Personnel; Portable Biosensor Device; Rapid Diagnosis; Inflammatory Biomarkers; Bacteria Detection; Microorganisms; Human Fluids; European Project; RAIS (HORIZON2020); Analytical Techniques; Clinical Diagnosis; Fast; Efficient; Reliable; Potential Application; Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; Blood Plasma; Direct Detection; Labeling-Free; Amplification-Free; Measurement Process Simplification; Vall D'Hebron Hospital; Real Patient Samples; Healthy Patients; Bacterial Infection; Incubation Time; Measurement Time; Classic Analysis Techniques; Good Correlation; Reliable Technology; Competitive Technology; Antibiotic Treatment; Patient Survival; Hospitalization Times; Healthcare System Savings; Simultaneous Detection Expansion; Other Microorganisms; Biomolecules.