Signatures de proteïnes en aspirats uterins per millorar el diagnòstic del càncer d'endometri. El projecte CEMARK

Elena Martínez García

Jaume Reventós Puigjaner Dr. Eva Colás Ortega Dr. Antonio Gil Moreno

Recerca Biomèdica en Ginecologia

El càncer d'endometri (CE) és el quart càncer més comú en les dones dels països desenvolupats, amb 61.380 casos nous i 10.920 morts estimades per al 2017 als Estats Units 1. Malauradament, les taxes de mortalitat per CE han augmentat en els darrers anys, principalment com a conseqüència del creixement i l'envelliment de la població. Actualment, el CE és la sisena causa de mort per càncer en les dones. Les pacients diagnosticades en etapes inicials de la malaltia presenten una taxa de supervivència global a 5 anys del 95%. No obstant això, el 30% de les pacients amb CE encara són diagnosticades en una etapa avançada de la malaltia, la qual cosa s'associa amb una disminució dràstica de la taxa de supervivència a 5 anys 1. En conseqüència, el diagnòstic precoç és una qüestió important per gestionar adequadament el CE i disminuir la mortalitat associada a aquesta malaltia. El sagnat uterí anormal (SUA) és un dels símptomes més comuns a les consultes ginecològiques. Tot i que només entre un 5 i un 10% de les dones amb uroplastica aguda (UAU) tindran una cirurgia endometrial (CE), es recomana a les dones amb aquest símptoma que consultin un especialista, ja que la UAU es produeix en el 90% dels casos de CE 2. Això representa que un gran nombre de dones amb trastorns benignes que presenten UAU necessiten sotmetre's a un procés diagnòstic per descartar la CE. El diagnòstic actual s'aconsegueix mitjançant l'examen histopatològic d'una biòpsia endometrial, que s'obté preferiblement per aspiració de la cavitat uterina (és a dir, aspirat uterí). Aquest procediment es pot realitzar a la consulta del metge i és mínimament invasiu, rendible i ben tolerat per les pacients. Malauradament, el nombre limitat de cèl·lules disponibles per a l'examen en aquestes biòpsies s'associa amb dues limitacions importants: i) una mitjana del 22% de les pacients no reben un diagnòstic final i necessiten sotmetre's a mètodes de mostreig més invasius 3; i ii) fins a un 50% de les pacients amb càncer d'endometri (CE) reben una assignació incorrecta de l'histotip i el grau de CE, cosa que pot comprometre el tractament quirúrgic òptim 4. En aquest context, l'objectiu principal de la tesi doctoral "Signatura de proteïnes en aspirats uterins per millorar el diagnòstic del càncer d'endometri. El projecte CEMARK" és la identificació de biomarcadors proteics en la fracció fluida d'aquests aspirats uterins, independentment del contingut cel·lular d'aquestes mostres, per superar aquestes limitacions. Per aconseguir aquest objectiu principal, la tesi doctoral va seguir les fases seqüencials del procés d'identificació de biomarcadors. Primer, es va realitzar una extensa revisió bibliogràfica i es va generar una llista de 506 proteïnes associades amb el CE. A continuació, vam demostrar que aquestes proteïnes, estudiades principalment per immunohistoquímica a nivell tissular, es podien mesurar en mostres d'aspirats uterins mínimament invasives mitjançant proteòmica basada en espectrometria de masses (MS) dirigida amb alta multiplexació. Posteriorment, vam dissenyar un flux de treball pas a pas per reduir la llista inicial de 506 biomarcadors candidats a 52 proteïnes. Aquestes proteïnes es van analitzar en la fracció fluida d'aspirats uterins de 20 pacients amb CE i 18 controls no CE amb AUB mitjançant l'adquisició de monitorització de reaccions paral·leles (LC-PRM), el mètode d'adquisició dirigida d'última generació utilitzat en un espectròmetre de masses precís d'alta resolució. Es va observar l'expressió diferencial de 26 proteïnes, i entre elles deu biomarcadors van mostrar una alta sensibilitat i especificitat per discriminar entre pacients amb CE i no CE (AUC > 0,9). A més, vam demostrar els beneficis de l'adquisició de LC-PRM per a la quantificació precisa d'un nombre elevat de biomarcadors candidats en mostres clíniques complexes. Les mateixes 52 proteïnes es van mesurar en els aspirats uterins de 116 pacients (69 pacients amb CE i 47 controls amb sospita de CE) mitjançant LC-PRM. El nivell diferencial de les 26 proteïnes anteriors es va validar en aquesta cohort independent de pacients. La combinació de MMP9 i KPYM va mostrar una sensibilitat del 94% i una especificitat del 87% per a la detecció de casos de CE. Aquest panell va complementar perfectament el diagnòstic histopatològic estàndard, aconseguint un 100% de diagnòstic correcte en aquest conjunt de dades. Nou proteïnes van augmentar significativament en les EC endometrioides (n = 49) en comparació amb les EC seroses menys comunes però més agressives (n = 20). La combinació de CTNB1, XPO2 i CAPG va aconseguir una sensibilitat del 95% i una especificitat del 96% per a la discriminació d'aquests subtipus histològics d'EC. Per tal de facilitar la implementació d'aquestes signatures de biomarcadors en la pràctica clínica, es va avaluar la traducció dels resultats de LC-PRM a kits ELISA disponibles comercialment, i la simplificació de l'assaig analític i la preparació de la mostra. El nostre següent objectiu era portar aquests resultats prometedors de la pràctica a la clínica com a prova de diagnòstic in vitro (IVD). En aquest sentit, a part del treball científic, altres camps són igualment importants per introduir amb èxit un producte al mercat. Durant l'últim any de la meva tesi doctoral vaig participar en diverses activitats de valorització en paral·lel al treball experimental. Com es mostra a la Figura 1, els resultats generats en aquesta tesi han estat protegits amb dues patents europees (PCT/EP2017/057635 per als biomarcadors de diagnòstic i EP17382483.0 per als biomarcadors de pronòstic) i s'ha dut a terme una anàlisi de "llibertat d'operació" de les proteïnes que formen els panells per avaluar si es pot produir i comercialitzar una prova de diagnòstic in vitro que inclogui aquestes proteïnes sense infringir els drets de propietat intel·lectual de tercers. És important destacar que he participat en diverses activitats de mentoria i networking ofertes per diverses subvencions que el projecte ha rebut, incloent-hi el "programa CaixaImpulse" promogut per la Fundació Caixa i Caixa Capital Risc, i el "programa global IDEA2" organitzat pel Massachusetts Institute of Technology (MIT) a Boston (EUA). També hem iniciat activitats d'investigació de mercat com ara entrevistes amb parts interessades (pacients, ginecòlegs, gestors d'hospitals, companyies farmacèutiques, etc.) i estudis farmacoeconòmics als diferents països on s'introduiria el producte. A més, vam ser seleccionats per participar en el programa MAP EADA organitzat per l'escola de negocis EADA i l'"Agencia para la Competitividad de la Empresa" que, juntament amb altres subvencions que el projecte va rebre, ens va ajudar en el disseny del pla de negoci per presentar-lo a inversors i possibles llicenciataris. Aquestes activitats i subvencions també ens van ajudar en la planificació dels propers passos a seguir.

Cancer is today one of the most common causes of death in the world, with over 8 million annual deaths 5. Early detection, i.e., finding tumors when they are still confined to the organ of origin, is crucial to favor complete resection of the tumor and to ensure a more effective treatment. The World Health Organization (WHO) has emphasized that the combination of current therapies with effective early detection would significantly impact survival 6. In this context, biomarkers have become a keystone of medical care to favor early detection and IVD testing is now an indispensable tool in the clinical environment 7. IVD is the largest sector of medical technology worldwide followed by cardiology and orthopedics, and it is expected to undergo the greatest sales growth of the medical technology sector during the period 2014-2020 8. EC is the fourth most common cancer in women in developed countries and its incidence and mortality rates are increasing annually worldwide. Moreover, around 94 million women in the world have an AUB annually, a symptom present in 90% of EC cases and thus, a large number of women with benign disorders presenting AUB need to undergo a diagnostic process to rule out EC. Despite the enormous efforts and investments made to identify protein biomarker signatures to improve early diagnosis of this disease, no protein has yet reached clinical use. The two proteomic signatures identified in the fluid fraction of uterine aspirates in this doctoral thesis are expected to have a greater impact on EC diagnosis. From one side, the diagnostic signature would perfectly complement the current diagnostic procedure based on the histological examination of the limited cellular fraction of these samples, precluding the use of subsequent invasive sampling methods such as dilatation and curettage or hysteroscopy. On the other hand, the prognostic signature would help to assist in the prediction of the optimal surgical treatment of EC patients. Altogether, the implementation of these signatures is expected to improve the management of EC patients and substantially reduce disease-related healthcare costs. Beyond these important achievements in the field of EC diagnosis, we believe that uterine aspirates might also be a novel promising source of protein biomarkers for other gynecological diseases such as endometriosis and ovarian cancer, two diseases that lack an effective diagnostic procedure. The optimization of the sample preparation and MS analysis, together with the stepwise proteomic workflow described in this thesis, will translate into a more efficient identification of clinically useful biomarker signatures in these complex uterine aspirate samples.

Endometrial Cancer (EC); Abnormal Uterine Bleeding (AUB); Uterine Aspirate; Protein Biomarkers; Mass Spectrometry (MS)-based Proteomics; LC-PRM; Diagnostic Biomarkers; Prognostic Biomarkers; In Vitro Diagnostics (IVD) Test; Patent Applications; Technology Transfer; Clinical Implementation; Multidisciplinary Collaboration; Market Research; Business Development; MMP9; KPYM; CTNB1; XPO2; CAPG