Diagnóstico clínico y detección de patógenos con un novedoso biosensor nanofotónico multiplexado para el punto de atención

Núria Fabri Faja

Alonso Chamarro, Julián Estevez Alberola, Mari Carmen Prof. Laura M. Lechuga

Sepsis is a clinical condition in which the immune system reacts aberrantly when a systemic infection occurs. Every year, 31 million cases of sepsis occur worldwide with an estimated mortality of 35%. The diagnosis of sepsis is criticized because every hour of delay in starting treatment leads to a significant reduction in the survival rate. In addition, the techniques used today (cell culture) for diagnosis usually take between 24 and 72 h and require specialized laboratories and trained personnel. That is why the main objective of this thesis is the development and application of a portable biosensor device for the diagnosis in less than one hour of sepsis through the direct and simultaneous detection of several inflammatory biomarkers and bacteria (and other microorganisms) in human fluids. This thesis is based on a European project called RAIS (HORIZON2020) and arises mainly motivated by the lack of analytical techniques and platforms for clinical diagnosis that are fast, efficient and reliable. The results obtained in this thesis have demonstrated the potential application of a new portable and integrated biosensor for the detection of two bacteria (Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa) in just 10 microliters (µL) of blood plasma. This detection has been done directly and without any type of labeling or amplification, which greatly simplifies the measurement process. In addition, thanks to the participation of a renowned public hospital, the Vall D'Hebron hospital, it has been possible to validate the biosensor with real patient samples. Specifically, it has been possible to discriminate between samples from healthy patients and samples from patients with bacterial infection (with sepsis) in less than an hour (30 minutes of incubation and 1 minute of measurement with the biosensor). These samples were analyzed with classic analysis techniques and a good correlation was obtained, which demonstrates that the technology is reliable and competitive. By applying this technology, the presence of infection in the blood can be detected quickly and easily in less than an hour, which will allow treatment with antibiotics to be started almost immediately. This will increase patient survival, shorten hospitalization times and, ultimately, represent significant savings for the healthcare system. It should be noted that the design of the biosensor will allow in the future to expand simultaneous detection to many more biomarkers such as other microorganisms or biomolecules.

El objetivo del proyecto fue la búsqueda de la detección múltiple y simultánea de diversos biomarcadores relacionados con la sepsis. En concreto, la tesis estudió la detección y cuantificación de tres proteínas de diferentes tamaños junto con dos bacterias comunes en casos de sepsis. Además, esta detección debía realizarse directamente, es decir, sin el uso de marcadores fluorescentes o cromóforos. Para ello, se optó por el formato de microarray, que consiste en la distribución ordenada y controlada de varios biorreceptores sobre la superficie sensora. Para la disposición de estos biorreceptores sobre las superficies sensoras, fue necesario utilizar y manejar tecnologías de dispensación de volumen capaces de distribuir cantidades minúsculas (nL) de soluciones de forma controlada. Gracias a esto, aunque en esta tesis hemos trabajado con tres biorreceptores de proteínas y dos de bacterias, en el futuro, con el uso de estas tecnologías, será posible colocar hasta 1600 biorreceptores diferentes distribuidos a lo largo de la superficie del sensor, lo que nos permitirá alcanzar uno de los multiplexores sin marcaje más altos. De los dos tipos de biomarcadores analizados, la detección directa de bacterias ha sido la estrategia más exitosa, ya que ha ofrecido mejores resultados y, sin duda, tiene un gran potencial para su aplicación directa en el ámbito clínico. Las dos bacterias con las que se ha trabajado han sido Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, y su detección individualizada ha demostrado que se pueden alcanzar límites de detección de 100 y 146 bacterias/ml, lo que, extrapolado al volumen de medición (10 microlitros de plasma sanguíneo), permite detectar directamente una o dos células bacterianas. Además, gracias a la colaboración del hospital público Vall d'Hebron, se han analizado diferentes muestras de pacientes reales. En concreto, el biosensor POC ha sido capaz de discriminar muestras de pacientes con sepsis de pacientes sanos. Todo ello utilizando únicamente los mencionados 10 µL de plasma de los pacientes y en menos de una hora (30 minutos de incubación más 1 minuto de lectura del biosensor). Asimismo, estas muestras se analizaron con técnicas de diagnóstico clásicas, obteniéndose una buena correlación. En resumen, todo esto ha demostrado que la combinación del biosensor POC con las metodologías de análisis bioquímico desarrolladas en la tesis proporciona una prueba rápida, eficaz y fiable que puede utilizarse como herramienta diagnóstica. Además, dado el grado de integración y portabilidad del biosensor POC, esta prueba puede realizarse sin necesidad de grandes infraestructuras como laboratorios microbiológicos especializados ni de personal altamente cualificado. Mediante la aplicación de esta tecnología, la presencia de infección puede detectarse de forma rápida, sencilla y en menos de una hora, lo que permitirá iniciar tratamientos antibióticos casi de inmediato. Esto aumentará la tasa de supervivencia, acortará la estancia hospitalaria y, en definitiva, supondrá un importante ahorro para los sistemas de salud pública. Asimismo, cabe añadir que, como se mencionó previamente, los biorreceptores se dispensan y ubican de forma controlada sobre la superficie nanosensora, de modo que, si bien en esta tesis el biosensor POC se ha aplicado para la detección de bacterias causantes de sepsis, en el futuro será posible inmovilizar biorreceptores relacionados con otros agentes infecciosos u otros biomarcadores relevantes para otras enfermedades. Cabe destacar también que, en la etapa de diseño del biosensor realizada para el proyecto europeo, se consideró desde el principio la aplicación del biosensor POC para que fuera compatible con cartuchos de un solo uso que contuvieran la superficie del sensor con los biorreceptores específicos para cada enfermedad o condición clínica. Esto permitiría a los hospitales disponer de la plataforma de diagnóstico portátil (el biosensor POC) y adquirir diferentes cartuchos dirigidos a distintas enfermedades. Por último, me gustaría añadir que, a partir de los resultados obtenidos, el grupo de investigación donde se ha realizado la tesis ha comenzado a negociar posibles acuerdos comerciales con empresas interesadas en disponer de sistemas tipo POC para el análisis rápido de infecciones y la posibilidad de extenderlo al estudio de la resistencia a los antibióticos del microorganismo detectado, con el fin de proporcionar de forma más eficaz la terapia más adecuada para cada paciente.

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