Firmas proteicas en aspirados uterinos para mejorar el diagnóstico del cáncer de endometrio. Proyecto CEMARK.

Elena Martínez García

Dr. Jaume Reventós Puigjaner Dra. Eva Colás Ortega Dr. Antonio Gil Moreno

Investigación biomédica en ginecología

El cáncer de endometrio (CE) es el cuarto cáncer más común en mujeres en países desarrollados, con 61.380 casos nuevos y 10.920 muertes estimadas para 2017 en Estados Unidos 1. Desafortunadamente, las tasas de mortalidad por CE han aumentado en los últimos años, principalmente como consecuencia del crecimiento y envejecimiento de la población. Actualmente, el CE es la sexta causa principal de muerte por cáncer en mujeres. Las pacientes diagnosticadas en etapas tempranas de la enfermedad presentan una tasa de supervivencia general a 5 años del 95%. Sin embargo, el 30% de las pacientes con CE aún son diagnosticadas en una etapa avanzada de la enfermedad, lo que se asocia con una disminución drástica en la tasa de supervivencia a 5 años 1. En consecuencia, el diagnóstico temprano es un problema importante para manejar adecuadamente el CE y disminuir la mortalidad asociada con esta enfermedad. El sangrado uterino anormal (SUA) es uno de los síntomas más comunes en las consultas ginecológicas. Aunque solo el 5-10% de las mujeres con SUA tendrán un CE, se alerta a las mujeres con este síntoma para que consulten a un especialista ya que el SUA ocurre en el 90% de los casos de CE 2. Esto representa que un gran número de mujeres con trastornos benignos que presentan SUA necesitan someterse a un proceso de diagnóstico para descartar CE. El diagnóstico actual se logra mediante el examen histopatológico de una biopsia endometrial, que se obtiene preferiblemente por aspiración de la cavidad uterina (es decir, aspirado uterino). Este procedimiento se puede realizar en el consultorio del médico y es mínimamente invasivo, rentable y bien tolerado por los pacientes. Desafortunadamente, el número limitado de células disponibles para examen en estas biopsias se asocia con dos limitaciones importantes: i) un promedio del 22% de los pacientes no reciben un diagnóstico final y necesitan someterse a métodos de muestreo más invasivos 3; y ii) hasta el 50% de las pacientes con CE reciben una asignación incorrecta del histotipo y grado de CE, lo que puede comprometer el tratamiento quirúrgico óptimo 4. En este contexto, el objetivo principal de la tesis doctoral "Firmas proteicas en aspirados uterinos para mejorar el diagnóstico del cáncer de endometrio. El proyecto CEMARK" es la identificación de biomarcadores proteicos en la fracción fluida de dichos aspirados uterinos, independientemente del contenido celular de estas muestras, para superar estas limitaciones. Para lograr este objetivo principal, la tesis doctoral siguió las fases secuenciales del proceso de identificación de biomarcadores. Primero, se realizó una extensa revisión bibliográfica y se generó una lista de 506 proteínas asociadas con CE. Posteriormente, demostramos que estas proteínas, estudiadas principalmente mediante inmunohistoquímica a nivel tisular, podían medirse en muestras de aspirado uterino mínimamente invasivas mediante proteómica basada en espectrometría de masas (MS) dirigida de alta multiplexación. Posteriormente, diseñamos un flujo de trabajo escalonado para reducir la lista inicial de 506 biomarcadores candidatos a 52 proteínas. Estas proteínas se analizaron en la fracción fluida de aspirados uterinos de 20 pacientes con CE y 18 controles no CE con SUA mediante la adquisición de monitorización de reacción paralela (LC-PRM), la última generación de método de adquisición dirigida utilizado en un espectrómetro de masas preciso de alta resolución. Se observó la expresión diferencial de 26 proteínas, y entre ellos diez biomarcadores mostraron una alta sensibilidad y especificidad para discriminar entre pacientes con CE y no CE (AUC > 0,9). Además, demostramos los beneficios de la adquisición LC-PRM para la cuantificación precisa de un gran número de biomarcadores candidatos en muestras clínicas complejas. Las mismas 52 proteínas se midieron luego en los aspirados uterinos de 116 pacientes (69 pacientes con CE y 47 controles con sospecha de CE) mediante LC-PRM. El nivel diferencial de las 26 proteínas anteriores se validó en esta cohorte independiente de pacientes. La combinación de MMP9 y KPYM exhibió una sensibilidad del 94% y una especificidad del 87% para detectar casos de CE. Este panel complementó perfectamente el diagnóstico histopatológico estándar, logrando un 100% de diagnósticos correctos en este conjunto de datos. Nueve proteínas aumentaron significativamente en CE endometrioides (n = 49) en comparación con CE serosas menos comunes pero más agresivas (n = 20). La combinación de CTNB1, XPO2 y CAPG logró una sensibilidad del 95% y una especificidad del 96% para la discriminación de estos subtipos histológicos de CE. Para facilitar la implementación de estas firmas de biomarcadores en la práctica clínica, se evaluó la traducción de los resultados de LC-PRM a kits ELISA disponibles comercialmente, y la simplificación del ensayo analítico y la preparación de la muestra. Nuestro siguiente objetivo fue llevar estos prometedores resultados del laboratorio a la clínica como una prueba de diagnóstico in vitro (IVD). En este sentido, además del trabajo científico, otros campos son igualmente importantes para introducir con éxito un producto en el mercado. Durante el último año de mi tesis doctoral participé en varias actividades de valorización en paralelo al trabajo experimental. Como se muestra en la Figura 1, los resultados generados en esta tesis han sido protegidos mediante dos patentes europeas (PCT/EP2017/057635 para los biomarcadores de diagnóstico y EP17382483.0 para los biomarcadores de pronóstico). Se ha realizado un análisis de las proteínas que componen los paneles para evaluar si una prueba de diagnóstico in vitro (DIV) que incluya dichas proteínas puede producirse y comercializarse sin infringir los derechos de propiedad intelectual de terceros. Cabe destacar que he participado en diversas actividades de mentoría y networking ofrecidas por diversas subvenciones que ha recibido el proyecto, incluyendo el programa CaixaImpulse, promovido por la Fundación Caixa y Caixa Capital Risc, y el programa global IDEA2, organizado por el Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) en Boston (EE. UU.). También hemos iniciado estudios de mercado, como entrevistas con las partes interesadas (pacientes, ginecólogos, gestores hospitalarios, compañías farmacéuticas, etc.) y estudios farmacoeconómicos en los diferentes países donde se introducirá el producto. Además, fuimos seleccionados para participar en el programa MAP EADA, organizado por la escuela de negocios EADA y la Agencia para la Competitividad de la Empresa. Este programa, junto con otras subvenciones recibidas por el proyecto, nos ayudó a diseñar el plan de negocio para presentarlo a inversores y posibles licenciatarios. Estas actividades y subvenciones también nos ayudaron a planificar los próximos pasos.

Cancer is today one of the most common causes of death in the world, with over 8 million annual deaths 5. Early detection, i.e., finding tumors when they are still confined to the organ of origin, is crucial to favor complete resection of the tumor and to ensure a more effective treatment. The World Health Organization (WHO) has emphasized that the combination of current therapies with effective early detection would significantly impact survival 6. In this context, biomarkers have become a keystone of medical care to favor early detection and IVD testing is now an indispensable tool in the clinical environment 7. IVD is the largest sector of medical technology worldwide followed by cardiology and orthopedics, and it is expected to undergo the greatest sales growth of the medical technology sector during the period 2014-2020 8. EC is the fourth most common cancer in women in developed countries and its incidence and mortality rates are increasing annually worldwide. Moreover, around 94 million women in the world have an AUB annually, a symptom present in 90% of EC cases and thus, a large number of women with benign disorders presenting AUB need to undergo a diagnostic process to rule out EC. Despite the enormous efforts and investments made to identify protein biomarker signatures to improve early diagnosis of this disease, no protein has yet reached clinical use. The two proteomic signatures identified in the fluid fraction of uterine aspirates in this doctoral thesis are expected to have a greater impact on EC diagnosis. From one side, the diagnostic signature would perfectly complement the current diagnostic procedure based on the histological examination of the limited cellular fraction of these samples, precluding the use of subsequent invasive sampling methods such as dilatation and curettage or hysteroscopy. On the other hand, the prognostic signature would help to assist in the prediction of the optimal surgical treatment of EC patients. Altogether, the implementation of these signatures is expected to improve the management of EC patients and substantially reduce disease-related healthcare costs. Beyond these important achievements in the field of EC diagnosis, we believe that uterine aspirates might also be a novel promising source of protein biomarkers for other gynecological diseases such as endometriosis and ovarian cancer, two diseases that lack an effective diagnostic procedure. The optimization of the sample preparation and MS analysis, together with the stepwise proteomic workflow described in this thesis, will translate into a more efficient identification of clinically useful biomarker signatures in these complex uterine aspirate samples.

Endometrial Cancer (EC); Abnormal Uterine Bleeding (AUB); Uterine Aspirate; Protein Biomarkers; Mass Spectrometry (MS)-based Proteomics; LC-PRM; Diagnostic Biomarkers; Prognostic Biomarkers; In Vitro Diagnostics (IVD) Test; Patent Applications; Technology Transfer; Clinical Implementation; Multidisciplinary Collaboration; Market Research; Business Development; MMP9; KPYM; CTNB1; XPO2; CAPG